Validación de un protocolo de técnica de reproducción asistida “ICSI” en la especie canina
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Date
2025-03-28
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Publisher
Universidad de Cuenca
Abstract
The intracytoplasmic sperm injection (ICSI) technique in oocytes is an assisted reproductive technology (ART) that represents a significant solution for fertility problems in various domestic species. The present technical project developed and validated a heterologous ICSI protocol through the microinjection of canine sperm into bovine oocytes. As a control for the ICSI fertilization process, homologous bovine in vitro fertilization (IVF) was performed. The effectiveness of fertilization by ICSI or IVF was evaluated by embryonic development (cleavage). The technical project was systematically structured following these stages: 1) in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes; 2a) heterologous ICSI using canine sperm; 2b) homologous IVF using bovine sperm; and 3) in vitro culture (IVC) of potential zygotes. Prior to the ICSI procedure, the equipment was carefully adjusted, including pneumatic microinjectors, three-dimensional micromanipulators, clamps, microinjection needle, and holding pipette. Canine sperm, thawed and selected, were immobilized in a buffer medium (PBS) supplemented with 10 % polyvinylpyrrolidone (PVP) and subsequently aspirated with the ICSI needle. The sperm microinjection was carried out by holding the oocytes with the holding pipette. Consequently, the inoculated oocytes were chemically activated with Ionomycin (10 µM) for 5 minutes. After 5 days of IVC, the cleavage rates of the embryos resulting from IVF and ICSI were stained (Hoechst) and evaluated by epifluorescence (UV filter, 380 nm). The results showed that heterologous ICSI (n = 53) produced a cleavage rate of 24. 5 %; however, homologous IVF achieved a rate of 52.4 % (n = 21). In conclusion, the heterologous ICSI protocol using canine sperm and bovine oocytes was validated, achieving successful cleavage rates. It is recommended that future studies develop homologous ICSI protocols in the canine species to assess their effectiveness.
Resumen
La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) en ovocitos es una técnica de reproducción asistida (TRA), la cual representa una significativa solución para los problemas de fertilidad en varias especies domésticas. El presente proyecto técnico desarrolló y validó un protocolo de ICSI heteróloga mediante la microinyección de espermatozoides caninos en ovocitos bovinos. Como control de proceso dela fecundación por ICSI, se realizó una fecundación in vitro (FIV) bovina homóloga. La efectividad de la fecundación por ICSI o por FIV se evaluó mediante el desarrollo embrionario (clivaje). El proyecto técnico fue estructurado sistemáticamente siguiendo las siguientes etapas: 1) maduración in vitro (MIV) de ovocitos bovinos; 2a) ICSI heteróloga usando espermatozoides caninos; 2b) FIV homologa empleando espermatozoides bovinos; y 3) cultivo in vitro (CIV) de posibles zigotos. Previo al proceso de la técnica ICSI, se ajustaron cuidadosamente los equipos que incluyeron los microinyectores neumáticos, micromanipuladores tridimensionales, abrazaderas, aguja de microinyección y pipeta de sujeción (holding). Los espermatozoides caninos, descongelados y seleccionados fueron inmovilizados en un medio tampón (PBS) suplementado con polivinil pirrolidona (PVP) al 10 %, y consecuentemente, aspirados con la aguja ICSI. La microinyección de los espermatozoides se realizó sujetando los ovocitos con la pipeta holding. Por consiguiente, los ovocitos inoculados fueron activados químicamente con Ionomicina (10 µM) durante 5 minutos. A los 5 días de la CIV, las tasas de división celular de los embriones resultantes de FIV e ICSI fueron teñidos (hoescht) y evaluados mediante Epifluorescencia (filtro UV, 320–400 nm). Los resultados evidenciaron que la ICSI heteróloga (n = 53) produjo una tasa de clivaje de 24,5 %; Sin embargo, la FIV homologa obtuvo una tasa de 52,4 % (n = 21). En conclusión, se validó el protocolo de ICSI heteróloga usando espermatozoides caninos con ovocitos bovinos, consiguiendo tasas exitosas de clivaje. Se recomienda, para futuros estudios, desarrollar protocolos de ICISI homologa en la especie canina para evaluar su efectividad.
Keywords
Medicina Veterinaria, Caninos, Ovocitos, División celular
Citation
Código de tesis
TV; 568
Código de tesis
Grado Académico
Médico Veterinario Zootecnista