Construcción de un vector de expresión bacteriano para la producción y purificación de proteínas recombinantes mediante la actividad de sortasa A de Staphylococcus aureus

Cárdenas Cordero, Janneth Fernanda

La sortasa A (SrtA) es una proteína con actividad endopeptidasa y transpeptidasa de bacterias Gram negativas, Gram positivas y arqueas utilizada como herramienta para diferentes aplicaciones biotecnológicas entre ellas la producción y purificación de proteínas recombinantes. El sistema de purificación basado en la actividad enzimática de SrtA optimiza el procesamiento de proteínas por lo tanto su utilización facilita la clarificación de proteínas de diferente naturaleza para alcanzar pureza considerable. Objetivo: El objetivo del presente trabajo fue generar un sistema de producción y purificación de proteínas recombinantes basado en la Sortasa A de Staphylococcus aureus (Sa-SrtA). Procedimiento: El sistema de purificación basado en la Sa-SrtA, se realizó a través de modificaciones sucesivas al vector pE15b NT-Histidina (H/His) (Novagen), desde la adición del segmento codificante (GenBank Ac.No.: AF162687) Δ60Sa-SrtA de S. aureus (ATCC12598), posteriormente se colocó la secuencia codificante del motivo consenso LPET4G, el sitio de reconocimiento de la Sa-SrtA, en donde se realizar el corte proteolítico para la separación de la proteína de interés. Para evaluar la funcionalidad del sistema, se movilizó el sitio de corte NdeI clonado en los sitios de restricción NdeI/BamHI. Río abajo del péptido LPET4G, se introdujo las secuencias codificantes de las proteínas antigénicas NcGRA7 (GenBank Ac.No.: U82229) y NcSAG4 (GenBank Ac.No.: AY763105) de Neospora caninum. Estos elementos permitieron la generación de construcciones genéticas para las proteínas de fusión: His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7 y -tag-Δ60Sa- SrtA-LPET4G-NcSAG4. Las construcciones fueron introducidas en la cepa de Escherichia coli Rosetta 2 (DE3) para la expresión de las proteínas. Las proteínas de fusión se purificaron mediante Cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC). En el proceso cromatográfico, las proteínas de fusión fueron capturadas en la resina de Ácido nitrilotriacético-níquel (Ni-NTA) y tras la adición de Ca2 + y Gli3 , la proteína de fusión inmovilizada sufre una escisión mediada por Δ60Sa-SrtA en la columna para liberar selectivamente las proteínas diana. Resultados: Se obtuvo un modelo bacteriano para la generación proteínas recombinantes purificadas mediante la actividad enzimática de la Δ60Sa-SrtA. El sistema permitió la purificación de la proteína recombinante de N. caninum 4G-NcGRA7 que podría ser utilizadas para la generación de sistema de diagnóstico. La expresión de la proteína 4G-NcSAG4 no se obtuvo por cuanto la proteína resultó insoluble en el sistema de expresión. Conclusiones: El sistema de purificación basado en Δ60Sa-SrtA es útil para el procesamiento de proteínas recombinantes.

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Título :	Construcción de un vector de expresión bacteriano para la producción y purificación de proteínas recombinantes mediante la actividad de sortasa A de Staphylococcus aureus
Autor:	Cárdenas Cordero, Janneth Fernanda
Director(es):	Vallecillo Maza, Antonio Javier
Correspondencia:	jannethfernanda@hotmail.es
Materia:	Biotecnología
Palabras clave :	Ingeniería Química Proteínas Sustancias bioquímicas
Nivel de audiencia:	Tesis de Maestría en Biociencias Aplicadas con mención en Biodescubrimiento
Área de conocimiento UNESCO amplio:	33 Ciencias Tecnológicas
ÁArea de conocimiento UNESCO detallado:	3302.90 Ingeniería Bioquímica
Área de conocimiento UNESCO específico:	3303 Ingeniería y Tecnología Químicas
Fecha de publicación :	13-abr-2022
Paginación:	50 páginas
Editor:	Universidad de Cuenca
Ciudad:	Cuenca
Código Interno :	TM4;1924
Tipo:	masterThesis
Resumen :	La sortasa A (SrtA) es una proteína con actividad endopeptidasa y transpeptidasa de bacterias Gram negativas, Gram positivas y arqueas utilizada como herramienta para diferentes aplicaciones biotecnológicas entre ellas la producción y purificación de proteínas recombinantes. El sistema de purificación basado en la actividad enzimática de SrtA optimiza el procesamiento de proteínas por lo tanto su utilización facilita la clarificación de proteínas de diferente naturaleza para alcanzar pureza considerable. Objetivo: El objetivo del presente trabajo fue generar un sistema de producción y purificación de proteínas recombinantes basado en la Sortasa A de Staphylococcus aureus (Sa-SrtA). Procedimiento: El sistema de purificación basado en la Sa-SrtA, se realizó a través de modificaciones sucesivas al vector pE15b NT-Histidina (H/His) (Novagen), desde la adición del segmento codificante (GenBank Ac.No.: AF162687) Δ60Sa-SrtA de S. aureus (ATCC12598), posteriormente se colocó la secuencia codificante del motivo consenso LPET4G, el sitio de reconocimiento de la Sa-SrtA, en donde se realizar el corte proteolítico para la separación de la proteína de interés. Para evaluar la funcionalidad del sistema, se movilizó el sitio de corte NdeI clonado en los sitios de restricción NdeI/BamHI. Río abajo del péptido LPET4G, se introdujo las secuencias codificantes de las proteínas antigénicas NcGRA7 (GenBank Ac.No.: U82229) y NcSAG4 (GenBank Ac.No.: AY763105) de Neospora caninum. Estos elementos permitieron la generación de construcciones genéticas para las proteínas de fusión: His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7 y -tag-Δ60Sa- SrtA-LPET4G-NcSAG4. Las construcciones fueron introducidas en la cepa de Escherichia coli Rosetta 2 (DE3) para la expresión de las proteínas. Las proteínas de fusión se purificaron mediante Cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC). En el proceso cromatográfico, las proteínas de fusión fueron capturadas en la resina de Ácido nitrilotriacético-níquel (Ni-NTA) y tras la adición de Ca2 + y Gli3 , la proteína de fusión inmovilizada sufre una escisión mediada por Δ60Sa-SrtA en la columna para liberar selectivamente las proteínas diana. Resultados: Se obtuvo un modelo bacteriano para la generación proteínas recombinantes purificadas mediante la actividad enzimática de la Δ60Sa-SrtA. El sistema permitió la purificación de la proteína recombinante de N. caninum 4G-NcGRA7 que podría ser utilizadas para la generación de sistema de diagnóstico. La expresión de la proteína 4G-NcSAG4 no se obtuvo por cuanto la proteína resultó insoluble en el sistema de expresión. Conclusiones: El sistema de purificación basado en Δ60Sa-SrtA es útil para el procesamiento de proteínas recombinantes.
Grado Académico:	Magíster en Biociencias Aplicadas
URI :	http://dspace.ucuenca.edu.ec/handle/123456789/38775
Aparece en las colecciones:	Tesis Maestrías

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