Optimización de RT-PCR para la evaluación de RNA de la levadura cándida parapsilosis sensu stricto por dos métodos comerciales basados en sistema de purificación por columnas de sílice

Jewtuchowicz, Virginia Marta; Rodriguez Coyago, Maria De lourdes; Rosa, Alcira Cristina

La especie Candida parapsilosis sensu stricto ha concentrado el interés médico como un patógeno nosocomial importante, siendo actualmente, la segunda levadura más aislada en candidemias e infecciones relacionadas a dispositivos médicos. Con el advenimiento de las tecnologías ómicas, como la genómica, la transcriptómica, la proteómica se ha mejorado el diagnóstico en micología y el conocimiento de las interacciones entre el huésped y su micobioma. Hasta el momento, no existe una metodología estandarizada para la extracción y purificación de RNA a partir de levaduras del género Candida, etapa crítica para realizar estudios de la expresión génica. Objetivo. Optimizar un procedimiento de RT-PCR para evaluar la extracción y purificación de RNA de aislamientos clínicos de C. parapsilosis sensu stricto, para su posterior estudio transcripcional, comparando concentración y pureza de dos equipos comerciales por columnas de sílica. Materiales y Métodos. Se utilizó una colección de 36 aislamientos caracterizados por métodos moleculares como Candida parapsilosis sensu stricto. A partir de aislamientos en medio Sabouraud y caldo YPD (peptona, dextrosa y extracto de levadura), se obtuvieron esferoplastos y se ensayaron dos equipos comerciales basados en extracción de RNA mediante columnas, según indicaciones del fabricante. Las soluciones de RNA obtenidas se cuantificaron con espectrofotómetro, utilizando una longitud de onda de 260, la relación A260/230 y se documentó la integridad del RNA y la contaminación con DNA genómico, mediante visualización directa en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Los resultados de pureza y rendimiento fueron procesados y analizados en Microsoft excel 2010 y paquete estadístico InfoStat 2016. Para transcribir el RNA a cDNA se utilizó retrotranscriptasa. Con el cDNA obtenido se procedió a realizar la RT-PCR mediante cebadores para amplificación de la región ITS, previamente optimizada. Resultados. El sistema Zymo research aportó el mayor rendimiento con una diferencia estadísticamente significativa sobre el sistema Qiagen (p=0,0015). E sistema Qiagen resultó más eficaz para generar un producto con menor contaminación de proteínas. Mientras que el sistema de Zymo research demuestra ser más efectivo a la hora de otorgar un producto de RNA menos contaminado con fenoles y carbohidratos. En ambos casos se obtuvo diferencias estadísticamente significativas. Conclusiones. Ambos procedimientos permitieron obtener RNA y cDNA de buena calidad y concentración en la especie Candida parapsilosis sensu stricto y son óptimos para utilizar en estudios transcripcionales. La elección del método de extracción deberá estar sujeto a varios aspectos, como el presupuesto, el organismo, y especialmente el objetivo del experimento.

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Título :	Optimización de RT-PCR para la evaluación de RNA de la levadura cándida parapsilosis sensu stricto por dos métodos comerciales basados en sistema de purificación por columnas de sílice
Otros títulos :
Autor:	Jewtuchowicz, Virginia Marta Rodriguez Coyago, Maria De lourdes Rosa, Alcira Cristina
Palabras clave :	Candida parapsilosis sensu stricto RNA RTpcr
Área de conocimiento FRASCATI amplio:	1. Ciencias Naturales y Exactas
Área de conocimiento FRASCATI detallado:	1.6.2 Microbiología
Área de conocimiento FRASCATI específico:	1.6 Ciencias Biológicas
Área de conocimiento UNESCO amplio:	05 - Ciencias Físicas, Ciencias Naturales, Matemáticas y Estadísticas
ÁArea de conocimiento UNESCO detallado:	0512 - Bioquímica
Área de conocimiento UNESCO específico:	051 - Ciencias Biológicas y Afines
Fecha de publicación :	2018
Fecha de fin de embargo:	31-dic-2050
Volumen:	Volumen 0, número 0
Fuente:	VIII Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínicas SADEBAC
Editor:	Asociación Argentina de Microbiología, Sociedad Argentina de Bacteriología
Ciudad:	Buenos Aires
Tipo:	ARTÍCULO DE CONFERENCIA
Abstract:
Resumen :	La especie Candida parapsilosis sensu stricto ha concentrado el interés médico como un patógeno nosocomial importante, siendo actualmente, la segunda levadura más aislada en candidemias e infecciones relacionadas a dispositivos médicos. Con el advenimiento de las tecnologías ómicas, como la genómica, la transcriptómica, la proteómica se ha mejorado el diagnóstico en micología y el conocimiento de las interacciones entre el huésped y su micobioma. Hasta el momento, no existe una metodología estandarizada para la extracción y purificación de RNA a partir de levaduras del género Candida, etapa crítica para realizar estudios de la expresión génica. Objetivo. Optimizar un procedimiento de RT-PCR para evaluar la extracción y purificación de RNA de aislamientos clínicos de C. parapsilosis sensu stricto, para su posterior estudio transcripcional, comparando concentración y pureza de dos equipos comerciales por columnas de sílica. Materiales y Métodos. Se utilizó una colección de 36 aislamientos caracterizados por métodos moleculares como Candida parapsilosis sensu stricto. A partir de aislamientos en medio Sabouraud y caldo YPD (peptona, dextrosa y extracto de levadura), se obtuvieron esferoplastos y se ensayaron dos equipos comerciales basados en extracción de RNA mediante columnas, según indicaciones del fabricante. Las soluciones de RNA obtenidas se cuantificaron con espectrofotómetro, utilizando una longitud de onda de 260, la relación A260/230 y se documentó la integridad del RNA y la contaminación con DNA genómico, mediante visualización directa en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Los resultados de pureza y rendimiento fueron procesados y analizados en Microsoft excel 2010 y paquete estadístico InfoStat 2016. Para transcribir el RNA a cDNA se utilizó retrotranscriptasa. Con el cDNA obtenido se procedió a realizar la RT-PCR mediante cebadores para amplificación de la región ITS, previamente optimizada. Resultados. El sistema Zymo research aportó el mayor rendimiento con una diferencia estadísticamente significativa sobre el sistema Qiagen (p=0,0015). E sistema Qiagen resultó más eficaz para generar un producto con menor contaminación de proteínas. Mientras que el sistema de Zymo research demuestra ser más efectivo a la hora de otorgar un producto de RNA menos contaminado con fenoles y carbohidratos. En ambos casos se obtuvo diferencias estadísticamente significativas. Conclusiones. Ambos procedimientos permitieron obtener RNA y cDNA de buena calidad y concentración en la especie Candida parapsilosis sensu stricto y son óptimos para utilizar en estudios transcripcionales. La elección del método de extracción deberá estar sujeto a varios aspectos, como el presupuesto, el organismo, y especialmente el objetivo del experimento.
URI :	http://dspace.ucuenca.edu.ec/handle/123456789/35757
URI Fuente:	https://www.aam.org.ar/vermas-proximos_eventos.php?n=293#
Aparece en las colecciones:	Artículos

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