Title: | Identificación y clonación de secuencias codificantes de peroxidasas de granos inmaduros de fréjol (Phaseolus vulgaris) |
Authors: | Espinoza Castro, Karla Esther |
metadata.dc.contributor.advisor: | Vallecillo Maza, Antonio Javier |
metadata.dc.ucuenca.correspondencia: | karlita_eec25@hotmail.com |
metadata.dc.subject.other: | Enzimas |
Keywords: | Bioquímica Sustancia bioquímica Proteínas Legumbres |
metadata.dc.audience.educationLevel: | Tesis de Maestría en Biociencias Aplicadas |
metadata.dc.ucuenca.areaconocimientounescoamplio: | 23 Química |
metadata.dc.ucuenca.areaconocimientounescodetallado: | 2302.90 Bioquímica de Alimentos |
metadata.dc.ucuenca.areaconocimientounescoespecifico: | 2302 Bioquímica |
Issue Date: | 9-Dec-2020 |
metadata.dc.ucuenca.embargoend: | 8-Dec-2021 |
metadata.dc.ucuenca.paginacion: | 27 páginas |
Publisher: | Universidad de Cuenca |
metadata.dc.description.city: | Cuenca |
Series/Report no.: | TM4;1775 |
metadata.dc.type: | masterThesis |
Abstract: | Peroxidases are hemoproteins whose catalytic activity is used in diagnostic tests, development of
biosensors and bioremediation, the most used are Horseradish (Armoracia rusticana) peroxidase or
HRP and Soybean (Glycine max) peroxidase or SBP. Currently these enzymes have a high cost, so it
is necessary to find alternatives for obtaining them and have immediate availability in the country for
application in the development of diagnostic tools. In the search for alternatives to commercial
peroxidase, a literature review was carried out to identify previously described sequences of SBP, the
localized sequences were used to identify orthologous coding sequences in Phaseolus vulgaris
(Common bean), with the identified sequences were designed oligonucleotides for the generation and
amplification of the respective cDNAs. After obtaining total RNA from immature grain cuticle,
synthesis of the cDNA and generation of PCR products was carried out. PCR products sequencing
results showed that it has been possible to obtain sequences encoding the orthologue peroxidase of
Ep (NP_001238315.1, NM_001251386 .1) and Prx2 (NP_001237601.1, NM_001250672.2) from
common bean. The sequences obtained in this work have a high identity with the reported sequences
in Ph. vulgaris, Ep (PHAVU_006G129900g) with 99.08 % and 99.69 % for Prx2
(PHAVU_003G078600g). Cloned coding peroxidases sequences in pET15b vector were induced
Escherichia coli Origami (DE3) and total protein extract obtained showed enzymatic activity on 3,3′-
diaminobenzidine, 4-chloro-1-naphthol and syringaldazine peroxidases substrates. Finally, the results
obtained allow us to conclude that it was possible to obtain two protein coding sequences with
peroxidase activity from Phaseolus vulgaris. |
Description: | Las peroxidasas son hemoproteínas cuya actividad catalítica se utiliza en pruebas de diagnóstico,
desarrollo de biosensores y biorremediación, las más utilizadas son la peroxidasa de rábano picante
(Armoracia rusticana) o HRP y la peroxidasa de soja (Glycine max) o SBP. Actualmente estas
enzimas tienen un alto costo, por lo que es necesario buscar alternativas que permitan obtenerlas y
disponer de manera inmediata en el país para su aplicación en el desarrollo de herramientas de
diagnóstico. En la búsqueda de alternativas a las peroxidasas comerciales, se realizó una revisión de
la literatura para identificar secuencias de SBP previamente descritas, las secuencias localizadas se
utilizaron para identificar secuencias codificantes ortólogas en fréjol (Phaseolus vulgaris), con las
secuencias identificadas se diseñaron oligonucleótidos para la generación y amplificación de los
ADNc respectivos. Después de obtener el ARN total de la cutícula de granos inmaduros, se llevó a
cabo la síntesis del ADNc y la generación de productos de PCR. Los resultados de la secuenciación
de los productos de PCR mostraron que ha sido posible obtener secuencias que codifican peroxidasas
ortólogas de Ep (NP_001238315.1, NM_001251386 .1) y Prx2 (NP_001237601.1,
NM_001250672.2) a partir de fréjol. Las secuencias obtenidas en este trabajo tienen una alta identidad
con las secuencias reportadas en P. Vulgaris, Ep (PHAVU_006G129900g) con 99.08% y 99.69%
para Prx2 (PHAVU_003G078600g). Las secuencias codificantes de peroxidasas clonadas en el vector
pET15b fueron inducidas en la cepa de Escherichia coli Origami (DE3) y el extracto de proteína total
obtenido mostró actividad enzimática sobre los sustratos de peroxidasas 3,3′-diaminobencidina, 4-
cloro-1-naftol y siringaldazina. Finalmente, los resultados obtenidos permiten concluir que fue
posible obtener dos secuencias codificantes de proteínas con actividad peroxidasa a partir de
Phaseolus vulgaris. |
metadata.dc.description.degree: | Magíster en Biociencias Aplicadas |
URI: | http://dspace.ucuenca.edu.ec/handle/123456789/35116 |
Appears in Collections: | Tesis Maestrías
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