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Title: Assessment of fertilizing ability of Merino ram semen cold-stored up to 48h by heterologous in vitro fertilization of bovine oocytes
Other Titles: 
Authors: Galarza Lucero, Diego Andres
Ladron de guevara, Magdalena
Beltran Breña, Paula
Sánchez Calabuig, María Jesús
Lopez Sebastian, Antonio
Santiago Moreno, Julián
Rizos, Dimitrios
metadata.dc.ucuenca.correspondencia: Galarza Lucero, Diego Andres, dgalarza@ucm.es
Keywords: Sper
Ram
Cold Stored
Fiv
Heterologous
metadata.dc.ucuenca.areaconocimientofrascatiamplio: 4. Ciencias Agrícolas
metadata.dc.ucuenca.areaconocimientofrascatiespecifico: 4.3 Medicina Veterinaria
metadata.dc.ucuenca.areaconocimientounescoamplio: 08 - Agricultura, Silvicultura, Pesca y Veterinaria
metadata.dc.ucuenca.areaconocimientounescodetallado: 0841 - Veterinaria
metadata.dc.ucuenca.areaconocimientounescoespecifico: 084 - Veterinaria
Issue Date: 2018
metadata.dc.ucuenca.volumen: volumen 31, número 1
metadata.dc.source: Reproduction, Fertility and Development
metadata.dc.identifier.doi: 10.1071/RDv31n1Ab137
Publisher: CSIRO Publishing
metadata.dc.description.city: 
Nueva Orleans
metadata.dc.type: ARTÍCULO DE CONFERENCIA
Abstract: 
The use of cold-stored ram semen has been applied in sheep artificial insemination programs, since it preserves its fertilizing ability similar to fresh. Besides, the heterologous in vitro fertilization (IVF) has been successfully employed to assess semen fertilizing ability in several species. Hence, we aimed to evaluate the fertilizing ability of ram semen cold-stored up to 48h at 5 ºC by assessing heterologous IVF using bovine oocytes. Fifteen pools of three normospermic Merino ram (2-7 years) ejaculates were collected using artificial vagina, diluted to 200x106 spermatozoa/ml with UHT-based extender (skim milk-6% egg yolk) and cold-stored up to 48h. In vitro matured zona-intact bovine oocytes were subjected to heterologous IVF using either fresh semen (FS, n=707), cold-stored to 24h (CS24, n=832) or cold-stored to 48h (CS48, n=611). In parallel, homologous IVF (Control, n=1356) and parthenogenesis (Parth Control non-fertilized oocytes n=334) were performed. Ram non-selected and selected (BoviPure) semen parameters were evaluated by CASA. Sperm-oocyte interaction was assessed at 2.5 hours post-insemination (hpi) by evaluating the number of bound spermatozoa whereas penetration and polyspermy were evaluated after 12 hpi. Presumptive zygotes were fixed and stained with Hoechst 33342 at 18, 20, 22, 24 and 26 hpi to assess pronuclear formation using phase contrast and confocal microscopy. Cleavage rate was evaluated in all groups at 48 hpi. Data obtained from 5 replicates was analysed using one-way ANOVA. Data was expressed as mean ± SEM. In terms of sperm storage time, non-selected semen showed a significant decrease (p<0.05) for CS24 and CS48h compared to FS on progressive motility [SPM (%): 52.30±4.1 and 36.9±5.5 vs 71.3±1.6] and straight-line velocity [VSL (mm/sec): 132.2±6.1 and 109.7±6.3 vs 176.7±4.3], respectively. However, selected semen showed a decrease (p<0.05) only for CS48h when compared to CS24h or FS on SPM (35.6±3.9 vs 56.1±6.91 and 59.3±2.6) and VSL (83.5±4.4 vs 105.3±6.5 and 110±2.0), respectively. No differences were observed between heterologous IVF groups in all parameters evaluated. Homologous IVF showed a higher percentage of penetration only when compared to heterologous FS group (44.4±6.8 vs 12.5±4.5%, p<0.01). The polyspermy was higher in heterologous CS24 group when compared to homologous IVF (11.4±3.4 vs 3.8±2.2, p<0.05). The homologous IVF group, as expected, showed the higher percentage of pronuclear formation at 18 hpi than heterologous IVF with FS (67.3±5.8 vs 35.2±5.6%), CS24 (72.1±4.5 vs 37.2±5.7%) and CS48 (63.0±6.0 vs 27.0±5.6%), respectively (p<0.001). Likewise, cleavage rate was higher in homologous group compared to heterologous IVF and parthenogenetic groups for FS (78.3±2.6.8 vs 46.3±3.2 and 7.0±2.3%), CS24 (78.4±2.6 vs 48.3±3.2 and 4.9±2.0%), and CS48 (78.4±3.3 vs 43.3±3.5 and 4.3±1.2%), respectively (p<0.001). In conclusion, Merino ram semen cold-stored up to 48h maintains its fertilization ability in the same extend as fresh and can be used for sheep crossbreeding programs
Description: 
El uso de semen ram almacenado en frío se ha aplicado en programas de inseminación artificial de ovejas, ya que conserva su capacidad de fertilización similar a la fresca. Además, la fertilización heteróloga in vitro (FIV) se ha empleado con éxito para evaluar la capacidad de fertilización del semen en varias especies. Por lo tanto, nuestro objetivo fue evaluar la capacidad de fertilización del semen de ram almacenado en frío hasta 48 horas a 5 ºC evaluando la FIV heteróloga utilizando ovocitos bovinos. Se recogieron quince grupos de tres eyaculados Normospermic Merino ram (2-7 años) usando vagina artificial, se diluyeron a 200x106 espermatozoides / ml con un extensor a base de UHT (leche descremada - 6% de yema de huevo) y se almacenaron en frío hasta 48 h. Los ovocitos bovinos de zona intacta madurados in vitro se sometieron a FIV heteróloga utilizando semen fresco (FS, n = 707), se almacenaron en frío a 24 h (CS24, n = 832) o se almacenaron en frío a 48 h (CS48, n = 611) . Paralelamente, se realizaron FIV homólogas (Control, n = 1356) y partenogénesis (Ovocitos no fertilizados de Control de Parth = 334). Los parámetros del semen no seleccionados y seleccionados (BoviPure) fueron evaluados por CASA. La interacción espermatozoide con ovocitos se evaluó a las 2,5 horas posteriores a la inseminación (hpi) mediante la evaluación del número de espermatozoides unidos, mientras que la penetración y la polispermia se evaluaron después de 12 hpi. Los supuestos cigotos se fijaron y se tiñeron con Hoechst 33342 a las 18, 20, 22, 24 y 26 hpi para evaluar la formación pronuclear utilizando contraste de fase y microscopía confocal. La tasa de escisión se evaluó en todos los grupos a 48 hpi. Los datos obtenidos de 5 réplicas se analizaron utilizando ANOVA de una vía. Los datos se expresaron como media ± SEM. En términos de tiempo de almacenamiento de esperma, el semen no seleccionado mostró una disminución significativa (p <0.05) para CS24 y CS48h en comparación con FS en motilidad progresiva [SPM (%): 52.30 ± 4.1 y 36.9 ± 5.5 vs 71.3 ± 1.6] y recto velocidad de línea [VSL (mm / s): 132.2 ± 6.1 y 109.7 ± 6.3 vs 176.7 ± 4.3], respectivamente. Sin embargo, el semen seleccionado mostró una disminución (p <0.05) solo para CS48h en comparación con CS24h o FS en SPM (35.6 ± 3.9 vs 56.1 ± 6.91 y 59.3 ± 2.6) y VSL (83.5 ± 4.4 vs 105.3 ± 6.5 y 110 ± 2.0 ), respectivamente. No se observaron diferencias entre los grupos de FIV heterólogos en todos los parámetros evaluados. La FIV homóloga mostró un mayor porcentaje de penetración solo en comparación con el grupo de FS heterólogo (44.4 ± 6.8 vs 12.5 ± 4.5%, p <0.01). La polispermia fue mayor en el grupo de CS24 heterólogo en comparación con la FIV homóloga (11.4 ± 3.4 vs 3.8 ± 2.2, p <0.05). El grupo de FIV homóloga, como se esperaba, mostró un mayor porcentaje de formación pronuclear a las 18 hpi que la FIV heteróloga con FS (67.3 ± 5.8 vs 35.2 ± 5.6%), CS24 (72.1 ± 4.5 vs 37.2 ± 5.7%) y CS48 (63.0 ± 6.0 vs 27.0 ± 5.6%), respectivamente (p <0.001). Del mismo modo, la tasa de escisión fue mayor en el grupo homólogo en comparación con la FIV heteróloga y los grupos partenogenéticos para el FS (78.3 ± 2.6.8 vs 46.3 ± 3.2 y 7.0 ± 2.3%), CS24 (78.4 ± 2.6 vs 48.3 ± 3.2 y 4.9 ± 2.0%) y CS48 (78.4 ± 3.3 vs 43.3 ± 3.5 y 4.3 ± 1.2%), respectivamente (p <0.001). En conclusión, el semen Merino ram almacenado en frío hasta 48 h mantiene su capacidad de fertilización en la misma extensión que el fresco y se puede usar para programas de cruzamiento de ovejas
URI: http://dspace.ucuenca.edu.ec/handle/123456789/33393
https://www.publish.csiro.au/RD/fulltext/RDv31n1Ab137
metadata.dc.ucuenca.urifuente: http://www.publish.csiro.au/rd/issue/9659
ISBN: 000-00-000
ISSN: 10313613
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